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第二天,王静姝打算验证这套试剂盒的真假,昨晚上睡前她已经把实验设计好了,现在她在记录本上写下步骤,然后就开始实验。王静姝习惯在实验前把步骤先写一遍,边写边在脑海里预演接下来的实验,每一个实验都要做最好的准备,确保实验过程不出问题。
原本实验预期结果是对照组没有表达,而实验组根据药物浓度不同也许表达量会有变化,但是昨天的结果确是实验组和对照组的数据都差不多,对照标准曲线,各组的表达量还不低。她确定自己没有加错样品,也没有互相污染,但这样的结果让她不得不对自己的记忆产生怀疑。因此,这一次她干脆使用基因水平PCR验证过没有表达L因子的细胞C来做实验,这样无论如何也不会被污染。
实验前样品会用试剂盒自带稀释液稀释A,那么再取其他几种替代稀释液的试剂,PBS缓冲液、1640细胞培养基和其他合格ELISA试剂盒的稀释液B。
单纯稀释液不加样品组:A,PBS,1640,B;
稀释液加样品C上清液组:A+C,PBS+才,1640+C,B+C。
每组各设复孔。
设定好分组,接着就是按照步骤一步一步来了。
先是加入上上述分组的各溶液孵育2小时,洗涤后在加带标记抗体孵育2小时。第二次孵育时刚好可以吃午饭了。
期间,她又做了些别的实验。后来她打开电脑查看邮箱,之前构建的质粒,酶切正确的送去测序,结果应该回来了。
果然,一般来说酶切正确的质粒基本上就没问题了,但那只是间接证明DNA条带大小符合,而测序则是直接证明条带的每一个碱基都是否一致。
如此,她就该扩大带质粒的大肠杆菌培养,然后提取较多的质粒用以接下去的实验。之前保存了带质粒的大肠杆菌菌种,直接化冻,接种到液体LB培养基中,然后放在恒温摇床里培养。当然这一步现在做早了,晚上的时候再接种,然后在摇床培养过夜,第二天,提取质粒。
下午大约2点的时候,上午开始做的ELISA就可以上酶标仪检测了。王静姝又期待又忐忑的操作起酶标仪。
结果出来了,除了标准品组,用试剂盒自带稀释液的A组和A+C组都显色,且数值相近!而其他组都没有显色!
也就是说问题就出在稀释液了,稀释液里存在一种抗原能够跟包被抗体和标记抗体结合。她现在基本上推测这个试剂盒是假的了,里面的抗体和标准品(对应抗原)极有可能选用某种常见的便宜的抗原抗体。得出这样的结论还需要做一个实验。
必须用含有L因子的细胞上清液来验证。如果含有L因子的上清加稀释液A显色,不加则不显色,那么确定这套ELISA体系里的抗体绝对不是L因子的抗体。
不过目前她还没有确定L因子一定会分泌到细胞外,因此她虽然构建了过表达L的细胞系,但取其上清液如果没有显色,也不能够说明问题。
但还有另一个办法,她已经订购了一支L因子抗体兔-Anti-L,应该过几天就到了,到时候可以用该试剂盒的+标准品+Anti-L+标记抗兔二抗,若结果没有显色则说明标准品不是L因子。这个到时候在做了,现在的结果也足以说明问题,至少稀释液有问题是百分百肯定的,她必须整理一下实验数据,发给孙老师,看他怎么说。
孙书淮看到实验结果后,问她:“这试剂盒哪买的?”
王静姝递过试剂请购单,上面谢了试剂货号、名称、品牌、代理商、规格、购买量、价格等信息还有购买人王静姝的签名,小组长李河的签名以及孙书淮教授的签名。
“这家代理